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　　動物細胞體外培養的歷史可追溯到1907年，美國生物學家Harrison在無菌條件下，以淋巴液為培養基成功地在試管中培養了蛙胚神經組織達 數周，創立了體外組織培養法。1962年，其規模開始擴大，隨著細胞生物學、培養系統及培養方法等領域的不斷豐富和完善，動物細胞培養技術得到了很大的發 展。發展至今已成為生物、醫學研究和應用中廣泛採用的技術方法，利用動物細胞培養生產具有重要醫用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等，已成為醫藥生物高技 術產業的重要部分。其發展簡史見表14-2。

　　利用動物細胞培養技術生產的生物製品已佔世界生物高技術產品市場份額的50%。大量資料表明，生物技術藥物是當前新藥開發的重要領域，生物技術 製藥工業是下一個10年製藥工業的重要新門類，期間將有數百種生物技術新藥上市。美國最新預測幾種暢銷基因工程藥物2000年全球銷售額EPO大於30億 美元,G2CSF大於20億美元,HGH、IFN、UK均大於10億美元,胰島素和降鈣素大於5億美元。動物細胞大規模培養技術是生物技術製藥中非常重要 的環節。目前,動物細胞大規模培養技術水平的提高主要集中在培養規模的進一步擴大、優化細胞培養環境、改變細胞特性、提高產品的產率與保證其質量上。

　　表14-2動物細胞培養技術的發展

　　一、動物細胞形態

　　(1)成纖維細胞型(fibrlblast或mechanocyte type)這種細胞形態與體內成纖維細胞形態相似故而得名。細胞體呈梭形或不規則三角形，中央有圓形核，胞質向外伸出2～3個長短不同的突起。細胞群常借 原生質突連接成網，生長時呈放射狀、漩渦或火焰狀走行[如圖14-l(a)]。除真正的纖維細胞外，凡由中胚層間充質來源的其他組織細胞，如血管內皮、心 肌、平滑肌、成骨細胞等，也多呈成纖維細胞形態。實際上很多所謂成纖維細胞並無產生纖維的能力，只是一種習慣上概括的稱法。

　　(2)上皮細胞型(epithilium cell type)這種細胞呈扁平的不規則三角形，中央有圓形核，生長時常彼此緊密連接單層細胞片[如圖14-1(b)]，起源於外胚層和內胚層組織的細胞，如皮 膚表皮及衍生物(汗腺、皮脂腺等)。腸管上皮、肝、胰和肺泡上皮細胞。培養時皆呈上皮型。

　　(3)遊走細胞型(wondering cell type)這種細胞的培養需要在支持物上生長，一般不連接成片，細胞胞質經常出現偽足或突起，呈活躍的遊走和變形運動，速度快而且方向不規則[如圖 14-1(c)]。此型細胞不很穩定，有時亦難和其他型細胞相區別，在一定條件下，如培養基化學性質變動等，它們也可能變為成纖維細胞型。

　　(4)多形性細胞型(polymorphic cell type)除上述三種細胞外，還有一些組織和細胞，如神經組織的細胞等，難以確定它們的穩定形態，可統歸多形性細胞[如圖14-1(d)]。

　　上述這四種細胞形態均屬於貼壁依賴型細胞，培養這類細胞時，常需貼附在支持物上生長。但由於培養環境的變化，細胞形態常發生改變。

　　(5)懸浮型細胞這類細胞常呈圓形，不貼附在支持物上，呈現懸浮狀態生長。如血液細胞，淋巴組織細胞及腫瘤細胞。培養這類細胞也可採用微生物培養的方法進行懸浮物培養。

　　二、動物細胞培養基組成及制備

　　1、培養基的組成

　　動物細胞培養的培養基分為天然培養基和合成培養基兩大類。天然培養基使用最早，營養成分高，也最為有效。但成分複雜，個體差異大，來源也缺乏， 因而使用受到限制。動物血清是細胞培養中用量最大的天然培養基，血清含有豐富的營養物質，包括大分子蛋白質和核酸等，對動物細胞的生長繁殖具有促進作用。 同時，血清對細胞貼壁和保護亦有明顯作用，且能中和有毒物質的毒性，使細胞不受傷害。

　　圖14-1動物細胞形態

（a）成纖維細胞型；（b）上皮細胞型；（c）遊走細胞型；（d）多形性細胞型

　　合成培養基是根據天然培養基的成分，用化學物質模擬合成的，具有一定的組成。但這種模擬不是被動和不加選擇的，而是在體外反覆實驗和篩選、進行 強化和重新組合後形成的人工合成培養基。這種培養基在很多方面有天然培養基無法相比的優點。它給細胞提供了一個近似體內生存環境，又便於控制和標準化的體 外生存環境。目前所有細胞培養室都己採用經標準化生產、組份和含量都相對固定的各種合成培養基，如Eagle基本培養基和更複雜的 NCTC109，TC199，HEM，DME，RPMI1640，McCoy5A，HAMF12等。儘管現代的合成培養基成份和含量已經較為複雜，但仍然 不能完全滿足體外培養細胞生長的需要。在合成培養基中都或多或少的要加入—定比例的滅然培養基加以補充。目前多採用胎牛血清、小牛血清、馬血清等，比例從 百分之幾到百分之幾十不等，要根據需要而定。其他各種天然培養基也可根據需要加入。

　　合成培養基的種類雖多，但一般都含有氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和一些其它輔助性成分。

　　(1)氨基酸必需氨基酸是動物細胞本身不能合成的，因此，在制備培養基時需加入必需氨基酸，另外還需要半胱氨酸和酪氨酸。而且由於細胞系不同， 對各種氨基酸的需要也不同。有時也加入其他非必需氨基酸，氨基酸濃度常常限制可得到的最大細胞密度，其平衡可影響細胞存活的生長速率。在細胞培養中，大多 數細胞需要谷氨酰胺作為能源和碳源。

　　(2)維生素Eagle基本培養基中只含B族維生素，其他維生素都靠從血清中取得。血清濃度降低時，對其他維生素的需求更加明顯，但也有些情況，即使血清存在，它們也必不可少。維生素限制可從細胞存活和生長速率看出，而不是以最大細胞密度為指標。

　　(3)碳水化合物碳水化合物是細胞生命的能量來源，有的是合成蛋白質和核酸的成分，主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸鈉等。

　　(4)無機鹽無機鹽是細胞的重要組成部分之一，它們積極參與細胞的代謝活動。無機鹽中Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO42-、 PO43-和HCO3-等金屬離子及酸根離子是決定培養基滲透壓的主要成分。對懸浮培養，要減少鈣，可使細胞聚集和貼壁最少，碳酸氫鈉濃度與氣相CO2濃 度有關。

　　(5)有機添加劑複雜培養基都含有核甘、檸檬酸循環中間體、丙酮酸、脂類、氧化還原劑如抗壞血酸、谷胱甘肽等及其他各種化合物。同樣，當血清量減少時，必須添加這種化合物，它們對克隆和維持這些特殊細胞有益。

　　(6)血清組織細胞培養中常用的天然培養基是血清。這是因為血清中含有大量的蛋白質、核酸、激素等豐富的營養物質，對促進細胞生長繁殖，粘附及 中和某些物質的毒性起著一定的作用。最常用的是小牛血清，胎牛血清。人血清用於一些人細胞系。大多數動物細胞培養必須在培養基中添加血清，但在許多情況 下，細胞可在無血清條件下維持和增殖。

　　目前合成培養基的配方都已相對固定，並形成配製好的干粉型商品。其成分趨於簡單化，以能維持細胞生長的最低需求，而去除了不必要的成份。同時為 適應某些特殊培養的需要補加—些新的成分，如培養雜交瘤細胞時採用DMEM培養基需補加丙酮酸鈉和2-硫基乙醇；為增加細胞轉化和DNA合成，有時補加植 物血凝素(PHA)等。這些變化需根據實驗和細胞的具體要求而定。

　　2、培養基制備以及制備過程中應考慮的因素

　　雖然各種培養基的組成各有不同、但形成商品化的干粉型培養基的配製方法卻大同小異。絕大多數合成培養基的生產都己標準化、商品化。較為常用的培 養基市場上很容易購得。這種干粉型培養基性質穩定，便於儲存、運輸、價格便宜，給使用和配製合成培養基帶來很大方便。一般的特殊需求也多可在現有合成培養 基基礎上補加或調整某些成份予以滿足。以往實驗室自購各個組份，稱量後再按一定順序進行溶解配製的老方法，一方面需購置大量各種各樣的成份，而且每種成份 用量很少，很難控制和統一；另一方面要精確稱量，順序溶解，步驟繁瑣，質量難以保證。除了因特殊需要而專門配製一些特殊培養基外，大部分已不再使用。

　　在制備培養基時，通常要考慮以下因素：

　　(1)pH值多數細胞繫在pH=7.4下生長得很好。儘管各細胞株之間細胞生長最佳pH值變化很小，但一些正常的成纖維細胞系以 pH=7.4～7.7最好，轉化細胞以pH=7.0～7.4更合適。據報道，上皮細胞以pH=5.5合適。為確定最佳pH值，最好做一個簡單的生長實驗或 特殊功能分析。

　　酚紅常用作指示劑，pH=7.4呈紅色，pH=7.0變橙色，pH=6.5變黃色，而pH=7.6呈紅色中略帶藍色，pH=7.8呈紫色。由於對顏色的觀察有很大的主觀性，因而必須用無菌平衡鹽溶液和同樣濃度的酚紅配一套標準樣，放在與制備培養基相同的瓶子中。

　　(2)緩衝能力碳酸鹽緩衝系統由於毒性小、成本低、對培養物有營養作用，因此比其他緩衝系統用得多。在生理pH值條件下的緩衝能力差。

　　(3)滲透壓多數培養細胞對滲透壓有很寬的耐受範圍，一般常用冰點降低或蒸汽壓升高測定。如果自己配培養基，可通過測定滲透壓防止稱量和稀釋等造成的誤差。

　　(4)粘度培養基的粘度主要受血清含量的影響，在多數情況下，對細胞生長沒有什麼影響。在攪拌條件下，用羧甲基纖維素增加培養基的粘度，可減輕細胞損害。這對在低血清濃度或無血清下條件下培養細胞顯得尤為重要。

　　三、動物細胞培養方法和環境要求

　　（一）動物細胞培養的方法

　　動物細胞的體外培養有兩種類型，一類是貼壁依賴性細胞，大多數動物細胞，包括非淋巴組織的細胞和許多異倍體體系的細胞部屬於這一類型。這一類需 採用貼壁培養。另一類是非貼壁依賴性細胞，來源於血液、淋巴組織的細胞，許多腫瘤細胞(包括雜交瘤細胞)和某些轉化細胞屬於這一類型。這—類可採用類似微 生物培養的方法進行懸浮培養。

　　所謂的貼壁培養是指大多數動物細胞在離體培養條件下都需要附著在帶有適量正電荷的固體或半固體的表面上才能正常生長，並最終在附著表面擴展成單 層。其基本操作過程是：先將採集到的活體動物組織在無菌條件下採用物理(機械分散法)或化學(酶消化法)的方法分散成細胞懸液，經過濾、離心、純化、漂洗 後接種到加有適宜培養液的培養皿(瓶、板)中，再放入二氧化碳培養箱進行培養。用此法培養的細胞生長良好且易於觀察，適於實驗室研究。但貼壁生長的細胞有 接觸抑制的特性，一旦細胞形成單層，生長就會受到抑制，細胞產量有限。如要繼續培養，還需將已形成單層的細胞再分散，稀釋後重新接種，然後進行傳代培養。

　　而懸浮培養是指少數懸浮生長型動物細胞在離體培養時不需要附著物，懸浮於培養液中即可良好生長。懸浮生長的細胞其培養和傳代都十分簡便。培養時 只需將採集到的活體動物組織經分散、過濾、純化、漂洗後，按一定密度接種於適宜培養液中，置於特定的培養條件下即可良好生長。傳代時不需要再分散，只需按 比例稀釋後即可繼續培養。此法細胞增殖快，產量高，培養過程簡單，是大規模培養動物細胞的理想模式。但在動物體中只有少數種類的細胞適於懸浮培養。

　　從培養方式來看，動物細胞無論是貼壁培養或是懸浮培養，均可採用分批式、分批補料式、半連續式、連續式等多種培養方式。從培養系統來看，主要採用中空纖維培養系統和微載體系統，且以灌注式連續培養方式為佳。

　　1、分批式培養(Batch culture)

　　分批式培養是指先將細胞和培養液一次性裝入反應器內進行培養，細胞不斷生長，同時產物也不斷形成，經過一段時間的培養後，終止培養。在細胞分批 培養過程中，不向培養系統補加營養物質，而只向培養基中通入氧，能夠控制的參數只有pH值、溫度和通氣量。因此細胞所處的生長環境隨著營養物質的消耗和產 物、副產物的積累時刻都在發生變化，不能使細胞自始至終處於最優的條件下，因而分批培養並不是一種理想的培養方式。分批培養過程特徵如圖14-2。

圖14-2動物細胞分批式培養過程的特徵

　　細胞分批式培養的生長曲線與微生物細胞的生長曲線基本相同。在分批式培養過程中，可分為延滯期、對數生長期、減速期、平穩期和衰退期等五個階段。

　　分批培養過程中的延滯期是指細胞接種後到細胞分裂繁殖所需的時間，延滯期的長短根據環境條件的不同而不同，並受原代細胞本身的條件影響。一般認 為，細胞延滯期是細胞分裂繁殖前的準備時期，一方面，在此時期內細胞不斷適應新的環境條件，另一方面又不斷積累細胞分裂繁殖所必需的一些活性物質，並使之 達到一定的濃度。因此，一般選用生長比較旺盛的處於對數生長期的細胞作為種子細胞，以縮短延滯期。

　　細胞經過延滯期後便開始迅速繁殖，進入對數生長期，在此時期細胞隨時間呈指數函數形式增長，細胞的比生長速率為一定值，根據定義

　　式中 t：培養時間（h）；

　　X0：細胞的初始濃度；

　　X：t時刻的細胞濃度；

　　μ：細胞的比生長速率。

　　細胞通過對數生長期迅速生長繁殖後，由於營養物質的不斷消耗、抑制物等的積累、細胞生長空間的減少等原因導致生長環境條件不斷變化，細胞經過減速期後逐漸進入平穩期，此時，細胞的生長、代謝速度減慢，細胞數量基本維持不變。

　　在經過平穩期之後，由於生長環境的惡化，有時也有可能由於細胞遺傳特性的改變，細胞逐漸進入衰退期而不斷死亡，或由於細胞內某些酶的作用而使細胞發生自溶現象。

圖14-3典型的分批培養隨時間的變化曲線

　　在分批培養過程中，與細胞的生長、代謝相關的主要參數有限制性營養物質濃度及其比消耗速率、細胞密度及其比生長速率、產物濃度及其生成速率、抑制物的濃度等。根據比速率的定義，分批式培養過程有下述方程：

式中 μ：細胞的比生長速率：

　　S：底物濃度

　　QS：基質比消耗速率；

　　P：產物濃度；

　　QP：產物比生產速率。

　　典型的分批培養隨時間變化的過程曲線如圖14-3所示。

　　由於分批式培養過程的環境隨時間變化很大，而且在培養的後期往往會出現營養成分缺乏或抑制性代謝物的積累使細胞難以生存，不能使細胞自始至終處於最優的條件下生長、代謝，因此在動物細胞培養過程中採用此法的效果不佳。

　　2、分批補料式培養(Fed-batch culture)

　　分批補料式培養是指先將一定量的培養液裝入反應器，在適宜的條件下接種細胞，進行培養，使細胞不斷生長，產物不斷形成，而在此過程中隨著營養物 質的不斷消耗，不斷地向系統中補充新的營養成分，使細胞進一步生長代謝，直到整個培養結束後取出產物。分批補料式培養只是向培養系統補加必要的營養成分， 以維持營養物質的濃度不變。由於分批補料式培養能控制更多的環境參數，使得細胞生長和產物生成容易維持在優化狀態。

　　分批補料式培養過程的特徵如圖14-4所示。分批補料式培養的特點就是能夠調節培養環境中營養物質的濃度：一方面，它可以避免在某種營養成分的 初始濃度過高時影響細胞的生長代謝以及產物的形成；另一方面，它還能防止某些限制性營養成分在培養過程中被耗盡而影響細胞的生長和產物的形成。同時在分批 補料式培養過程中，由於新鮮培養液的加入，整個過程的反應體積是變化的。

圖14-4流加式培養過程的特徵

　　根據分批補料控制方式不同，有兩種分批補料式培養方式：無反饋控制流加和有反饋控制流加。無反饋控制流加包括定流量流加和間斷流加等；有反饋控 制流加一般是連續或間斷地測定系統中限制性營養物質的濃度，並以此為控制指標來調節流加速率或流加液中營養物質的濃度等。由於分批補料式培養的反應體積不 斷變化，培養過程中的各參數變化可寫為

式中 V：培養液的體積；

　　F（t）：流加液的流速；

　　S：流加液的基質濃度；

　　YX/S：基於一定基質的細胞產率；

　　M：維持常數。

　　3、半連續式培養(Semi-continuous culture)

　　半連續式培養是在分批式培養的基礎上，將分批培養的培養液部分取出，並重新補充加入等量的新鮮培養基，從而使反應器內培養液的總體積保持不變的培養方式。

　　在半連續式培養過程，如反應器內的培養液體積為V，換液量為V′，替換率D=V′/

　　V。對於懸浮培養，D′與比生長速率μ′有如下的關係

4、連續式培養(Continuous culture)

　　連續式培養是指將細胞種子和培養液一起加入反應器內進行培養，一方面新鮮培養液不斷加入反應器內，另一方面又將反應液連續不斷地取出，使反應條 件處於一種恆定狀態。與分批式培養不同，連續式培養可以保持細胞所處環境條件長時間地穩定，可以使細胞維持在優化的狀態下，促進細胞的生長和產物的形成。 由於連續式培養過程可以連續不斷地收穫產物，並能提高細胞密度，在生產上已被應用於培養非貼壁依賴性細胞。

　　動物細胞的連續培養一般是採用灌注培養。灌注培養是把細胞接種後進行培養，一方面連續往反應器中加入新鮮的培養基，同時又連續不斷地取出等量的 培養液，但是過程中不取出細胞，細胞仍留在反應器內，使細胞處於一種營養不斷的狀態。高密度培養動物細胞時，必須確保補充給細胞足夠的營養以及除去有毒的 代謝物。灌注培養時用新鮮培養液進行添加，確保上述目的實現。通過調節添加速度，則使培養保持在穩定的、代謝副產物低於抑制水平的狀態。採用此法，可以大 大提高細胞的生長密度，有助於產物的表達和純化。

　　對於有細胞排出的培養系統，進行物料街算可得：

式中 V：反應器工作體積；

　　F：培養液流入(或流出)速率；

　　Sin：流入液中限制性營養物質濃度；

　　S：反應器內該物質濃度，其餘同前。

　　若令稀釋率D＝F/V，則可得出狀態方程：

　　在穩定狀態下，μ=D，即細胞比生長速率與稀釋率相等。換言之，對於懸浮細胞的培養，當有細胞排出時，稀釋率不得大於細胞最大比生長速率，否則 細胞便會全部洗出。對於貼壁依賴性細胞(或細胞不被排出的情況下)，細胞密度的增加受生長表面的限制，式(14-12)不適用，但是，稀釋率過高，產物濃 度勢必下降，培養液消耗也上升，因此，需要進行優化，從而有效地提高生產率。

　　由於連續培養過程可以連續不斷地收穫產物，並能提高細胞密度，因此，在生產中廣泛被採用。如英國Celltech公司採用灌注培養雜交瘤細胞， 連續不斷地生產單克隆抗體，獲得巨大經濟效益。雖然灌注培養具有不少優點，但也存在培養基消耗量比較大，操作過程複雜，培養過程中，易受污染等缺點。

　　（二）細胞培養的環境要求

　　細胞的生長、繁殖和代謝等生理性質，在很大程度上受各種環境因素的影響。為了使動物細胞反應處於最佳狀態，瞭解環境因素對其影響無疑是很重要的。影響動物細胞生長、繁殖的環境因素很多，主要有細胞生長的支持物、氣體交換、培養溫度、pH、滲透壓及其它因素等方面。

　　1、支持物

　　體外培養的大多數動物細胞需在人工支持物上單層生長。在早期的實驗中，用玻璃作為支持物，開始是由於它的光學特性，後來發現它具有合適的電荷適合於細胞貼壁和生長。

　　(1)玻璃玻璃常用作支持物。它很便宜，容易洗滌，且不損失支持生長的性質，可方便地用於乾熱或濕熱滅菌，透光性好，強鹼可使玻璃對培養產生不良影響，但用酸洗中和後即可。

　　(2)塑料製品一次性的聚苯乙烯瓶是一種方便的支持物。但製成的聚苯乙烯是疏水性的，但它不適合於細胞生長，所以細胞培養用的塑料用品要用γ射 線、化學藥品或電弧處理使之產生帶電荷的表面，具有可潤濕性。它光學性質好，培養表面平。除此之外，細胞也可在聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯和其他塑料 上生長。

　　(3)微載體大規模動物細胞貼壁培養最常用的支持物是微載體。其材料有聚苯乙烯、交聯葡萄糖、聚丙烯酰胺、纖維素衍生物、幾丁質、明膠等。通常 用特殊的技術製成100～200μm直徑的圓形顆粒，微載體的制備是一種較複雜的技術，微載體的價格一般也比較貴。但它的最大優點是使貼壁細胞可以像懸浮 培養那樣進行。微載體表面光滑，有的還在表面深層，使表面帶有少量正電荷，適合於細胞貼附。微載體大多都是一次性的，不能重複使用。

　　支持物通過各種預處理後，可改善細胞的貼壁和生長性能。用過的玻璃容器比新的更適合細胞生長。這可能歸因於培養後的表面的蝕刻和剩餘的微量物質，培養瓶中細胞的生長也可以改善表面以利第二次接種，這類調節因素可能是由於細胞釋放出的膠原或黏素。

　　2、氣體交換

　　(1)氧氣氣相中的重要成分是氧氣和二氧化碳。各種培養對氧的要求不同，大多數動物細胞培養適合於大氣中的氧含量或更低些。據報道，對培養基硒含量的要求與氧濃度有關，硒有助於除去呈自由基狀態的氧。在大規模細胞培養中，氧可能成為細胞密度的限制因素。

　　(2)二氧化碳二氧化碳對動物細胞培養起著相對複雜的作用，氣相中的C02濃度直接調節溶解態C02的濃度，溶解態的C02受溫度影響，C02溶於培養基中形成H2C03，產生H2C03又能再離解：

　　由於HCO3-與多數陽離子的離解數很小，趨於結合態，故使培養基變酸。提高氣相中CO2含量的結果是降低培養液pH值，而它又被加入NaHC03濃度所中和：

　　若HCO3-濃度增加，則式(14-18)平衡向左邊移動，直到系統在pH=7.4達到平衡。如果換用其他物質，如NaOH，實際效果是一樣的：

3、培養溫度

　　溫度是細胞在體外生存的基本條件之一，來源不同的動物細胞，其最適生長溫度不盡相同。例如魚屬變溫動物，魚細胞對溫度變化耐受力較強，冷水、涼 水、溫水魚細胞適宜培養溫度分別為20℃、23℃、26℃，昆蟲細胞為25~28℃，人和哺乳動物細胞最適宜的溫度為37℃，溫度不超過39℃。細胞代謝 強度與溫度成正比，偏高於此溫度範圍，細胞的正常代謝和生長將會受到影響，甚至導致死亡。總的來說，細胞對低溫的耐受力比對高溫的耐受力強；如溫度上升到 45℃時，在1h內細胞即被殺死。在4l~42℃雖然細胞尚能生存，但為時很短，10~24h後即褪變或死亡。相反，降低溫度把細胞置於25~35℃時， 它們仍能生長，但速度緩慢，並維持長時間不死，放在4℃，數小時後再置於37℃培養細胞仍繼續生長。如溫度降至冰點以下，細胞可因胞質結冰而死亡。但如向 培養液中加入保護劑(二甲基亞砜或甘油)，可以把細胞凍結貯存於液氮中，溫度達-196℃，能長期保存下去，解凍後細胞復甦，仍能繼續生長。

　　一般來說，變溫動物細胞有較大的溫度範圍，但應保持在一個恆定值，且在所屬動物的正常溫度範圍內，培養反應器既能加熱，又能冷卻，因為培養溫度可能要求低於環境溫度。

　　溫度調節的範圍最大不超過±0.5℃。培養溫度不僅始終一致，而且在培養器各個部位都應恆定，在培養中溫度的恆定比準確更重要。

　　4、pH

　　合適的pH也是細胞生存的必要條件之一，動物細胞合適的pH值一船在7.2~7.4，低於6.8或高於7.6都對細胞產生不利的影響，嚴重時可 導致細胞褪變或死亡。不同細胞對pH也有不同要求：原代培養細胞對pH變動耐受性差，傳代細胞系耐受性較強。對於同一種細胞，生長期和維持期最適pH也不 盡相同，對大多數細胞來說，偏酸性環境比鹼性環境更利於生長，如有人證明，原代羊水細胞培養在pH6.8時最適。

　　初代培養的新鮮組織或經過消化成分散狀態的細胞，對環境的適應力差，此時應嚴格控制培養基的pH值，否則，細胞難以生長。細胞量少時比細胞量多 時對pH變動耐力差。生長旺盛細胞代謝強，產生CO2多，培養基pH下降快，如果CO2從培養環境中逸出，則pH升高。上述兩種情況對細胞都將產生不利影 響。因此，維持細胞生存環境中的pH是至關重要的。最常用的方法是加磷酸緩衝液，緩衝液中的碳酸氫鈉，具有調節CO2的作用，因而在一定範圍內可調節培養 基的pH值。由於CO2容易從培養環境中逸出，故只適用封閉式培養。為克服碳酸氫鈉的這個缺點，有時也採用羥乙基哌秦乙烷硝酸(HEPES)，它對細胞無 甚作用，主要是防止pH迅速波動，具有較強的穩定培養基pH的能力。

　　5、滲透壓

　　滲透壓對動物細胞也有影響。有些動物細胞如HeLa細胞或其它確定細胞系，對滲透壓具有較大耐受性，而原代細胞和正常二倍體細胞對滲透壓波動比較敏感。人血漿滲透壓約290mOsm/kg，為細胞的理想滲透壓，對多數細胞來說，260~320mOsm/kg是適宜的。

　　6、其它因素

　　除上述因素外，其它因素如血清、剪切力等對細胞也有很大影響。總之，影響動物細胞生長及產物合成的因素很多，由於情況比較複雜，需要根據具體情況進行分析。

　　動物細胞的體外培養有兩種類型，一類是貼壁依賴性細胞，大多數動物細胞，包括非淋巴組織的細胞和許多異倍體體系的細胞部屬於這一類型。這一類需 採用貼壁培養。另一類是非貼壁依賴性細胞，來源於血液、淋巴組織的細胞，許多腫瘤細胞(包括雜交瘤細胞)和某些轉化細胞屬於這一類型。這—類可採用類似微 生物培養的方法進行懸浮培養。

　　四、動物細胞大規模培養工藝

　　大規模動物細胞培養的工藝流程如圖14-5所示，先將組織切成碎片，然後用溶解蛋白質的酶處理得到單個細胞，收集細胞並離心。獲得的細胞植入營 養培養基中，使之增殖至覆蓋瓶壁表面，用酶把細胞消化下來，再接種到若干培養瓶以擴大培養，獲得的細胞可作為「種子」進行液氮保存。需要時，從液氮中取出 一部分細胞解凍，復活培養和擴培，之後接入大規模反應器進行產品生產。需要誘導的產物或者病毒感染後才能得到產物的細胞，需在生產過程中加入適量的誘導物 或感染病毒，再經分離純化獲得目的產品。

圖14-5大規模動物細胞培養工藝流程

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微生物批次培養的生長曲線

圖14-3典型的分批培養隨時間的變化曲線

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